page_banner

Yangiliklar

Haqiqiy vaqtda floresan miqdoriy Pcr printsipi texnikasi va ilovalari

Haqiqiy vaqtda floresan miqdoriy PCR - bu florofor yordamida DNKni kuchaytirish reaktsiyasida har bir polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) tsiklidan keyin mahsulotning umumiy miqdorini o'lchash usuli.Usul ichki yoki tashqi mos yozuvlar usullari bilan tekshirilishi kerak bo'lgan namunadagi aniq DNK ketma-ketligini aniqlash uchun ishlatiladi.Yaratilganidan beri lyuminestsent miqdoriy PCR tahlillari laboratoriya o'qituvchilari orasida tobora ommalashib bormoqda.

Floresan PCR printsipi: Floresan PCR, dastlab TaqManPCR va keyinchalik Real-TimePCR deb nomlanadi, 1995 yilda AQShda PE (PerkinElmer) tomonidan ishlab chiqilgan nuklein kislota miqdorini aniqlashning yangi usuli. uning miqdoriy funktsiyasiga erishish uchun an'anaviy PCR ga floresan bo'yoq.Printsip: PCR reaktsiyasi davom etar ekan, PCR reaktsiyasi mahsulotlari to'planadi va floresan signalning intensivligi teng nisbatda ortadi.Har bir tsikl bilan floresans intensivligi signali yig'iladi, shuning uchun biz flüoresan intensivligining o'zgarishi bo'yicha mahsulot miqdori o'zgarishini kuzatishimiz va shu tariqa floresans kuchayish egri grafigini olishimiz mumkin.

Haqiqiy vaqtda floresan 3
Haqiqiy vaqtda floresan 2

Umuman olganda, floresan kuchaytirish egri chizig'ini uch fazaga bo'lish mumkin: floresan fon signali fazasi, floresans signalining eksponensial kuchaytirish bosqichi va plato fazasi.Fon signali bosqichida kuchaytirilgan floresans signali floresan fon signali bilan maskalanadi va mahsulot miqdoridagi o'zgarishlarni aniqlab bo'lmaydi.Plato bosqichida kuchaytirish mahsuloti endi eksponent ravishda o'smaydi, yakuniy mahsulot miqdori va boshlang'ich shablon miqdori o'rtasida chiziqli bog'liqlik yo'q va boshlang'ich DNK nusxasi raqamini yakuniy PCR mahsulot miqdori asosida hisoblab bo'lmaydi.Faqatgina lyuminestsent signalning eksponensial kuchaytirish bosqichida PCR mahsuloti miqdori va boshlang'ich shablon miqdorining logarifmi o'rtasida chiziqli bog'liqlik mavjud va biz ushbu bosqichda bu miqdorni tanlashimiz mumkin.Miqdorni aniqlash va taqqoslash qulayligi uchun real vaqt rejimida lyuminestsent miqdoriy PCR texnikasiga ikkita juda muhim tushuncha kiritildi: floresans chegarasi va KT qiymati.

Eshik - floresan kuchaytirish egri chizig'ida sun'iy ravishda o'rnatilgan qiymat.PCR kuchaytirilishining eksponensial bosqichi.

Ct qiymati: har bir reaksiya trubkasidagi floresans signali belgilangan domen qiymatiga erishish uchun o'tgan davrlar soni.

Ct qiymati va boshlang'ich shablon o'rtasidagi bog'liqlik: tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, har bir shablonning Ct qiymati ushbu shablonning boshlang'ich nusxasi raqamining logarifmi bilan chiziqli munosabatga ega, boshlang'ich nusxa raqami qancha ko'p bo'lsa, Ct shunchalik kichik bo'ladi. qiymat.Ct qiymatlari nisbatan barqaror.Standart egri chiziq boshlang'ich nusxasi ma'lum bo'lgan standart yordamida amalga oshirilishi mumkin, bu erda gorizontal koordinata boshlang'ich nusxa raqamining logarifmini va vertikal koordinata Ct qiymatini quyidagi rasmda ko'rsatilgandek ifodalaydi.

Shuning uchun, noma'lum namunaning Ct qiymatini olish orqali ushbu namunaning boshlang'ich nusxasi raqamini standart egri chiziqdan hisoblash mumkin.

Ct qiymati doimiy emas va turli namunalar va turli asboblar ta'sirida bo'lishi mumkin, hatto bir xil asbobda bir xil namuna 2 marta takrorlangan bo'lsa ham, Ct qiymati o'zgarishi mumkin.

Miqdoriy floresan tahlillari: Kantitativ floresan tahlillari ishlatiladigan markerlarga qarab lyuminestsent problar va floresan bo'yoqlarga bo'linishi mumkin.Floresan zondlariga Beacon texnologiyasi (Amerika Tagyi tomonidan taqdim etilgan molekulyar mayoq texnologiyasi), TaqMan problari (ABI tomonidan taqdim etilgan) va FRET texnologiyasi (Roche vakili);lyuminestsent bo'yoqlarga to'yingan floresan bo'yoqlar va to'yinmagan floresan bo'yoqlar kiradi, to'yinmagan floresan bo'yoqlarning tipik vakili SYBRGreen I bo'lib, u hozir keng tarqalgan;to'yingan To'yinmagan floresan bo'yoqlarning tipik vakili SYBRGreenⅠ;to'yingan floresan bo'yoqlar EvaGreen, LCGreen va boshqalar.

SYBRGreenI lyuminestsent PCR uchun tez-tez ishlatiladigan DNK bog'lovchi bo'yoq bo'lib, u ikki ipli DNKga xos bo'lmagan tarzda bog'lanadi.Erkin holatda SYBRGreenI zaif floresans chiqaradi, lekin bir marta ikki zanjirli DNK bilan bog'langandan so'ng, uning floresansi 1000 barobar ortadi.Shuning uchun reaksiya natijasida chiqarilgan umumiy floresans signali mavjud bo'lgan ikki zanjirli DNK miqdoriga mutanosib bo'ladi va kuchaytiruvchi mahsulot ortib borishi bilan ortadi.

Ikki zanjirli DNKni bog'lovchi bo'yoqlarning afzalliklari: oddiy eksperimental dizayn, atigi 2 primer kerak, problarni loyihalashning hojati yo'q, bir nechta genlarni tezkor sinovdan o'tkazish uchun bir nechta zondlarni loyihalashning hojati yo'q, erish nuqtasi egri tahlilini o'tkazish qobiliyati, o'ziga xosligini tekshirish. kuchaytirish reaktsiyasi, past boshlang'ich xarajat, yaxshi umumiylik va shuning uchun uyda va chet elda tadqiqotlarda ko'proq qo'llaniladi.

Floresan prob usuli (Taqman texnikasi): PCR kuchaytirilishi amalga oshirilganda, maxsus lyuminestsent prob bilan birga bir juft primer qo'shiladi.Prob buzilmagan bo'lsa, muxbirlar guruhi tomonidan chiqarilgan floresans signali o'chirilgan guruh tomonidan so'riladi va PCR asbobi tomonidan aniqlanmaydi;PCR amplifikatsiyasi paytida (kengayish bosqichida) Taq fermentining 5'-3' bo'linish faolligi probni enzimatik ravishda buzadi, bu esa reportyor floresans guruhini va söndürülmüş floresans guruhini yaratadi.

Floresan miqdoriy PCR qo'llanilishi.

Molekulyar biologiya tadqiqotlari:

1. Nuklein kislotalarning miqdoriy tahlili.Yuqumli kasalliklarni miqdoriy va sifat jihatidan tahlil qilish, patogen mikroorganizmlarni yoki viruslarni aniqlash, masalan, yaqinda A (H1N1) grippi epidemiyasi, transgen o'simliklar va hayvonlarning gen nusxalari sonini aniqlash, RNK genini inaktivatsiya qilish tezligini aniqlash va boshqalar.

2. Differensial gen ekspressiyasi tahlili.Davolangan namunalar o'rtasidagi gen ekspressiyasidagi farqlarni solishtirish (masalan, dori-darmon bilan davolash, fizikaviy ishlov berish, kimyoviy ishlov berish va boshqalar), turli fazalardagi o'ziga xos genlarning ekspression farqlari va cDNK mikroarray yoki differentsial ifoda natijalarini tasdiqlash

3. SNPni aniqlash.Yagona nukleotid polimorfizmlarini aniqlash turli kasalliklarga individual sezuvchanlikni yoki o'ziga xos dorilarga individual javobni o'rganish uchun muhimdir va molekulyar mayoqlarning aqlli tuzilishi tufayli SNP ketma-ketligi ma'lumotlari ma'lum bo'lgandan so'ng, uni aniqlash oson va aniq bo'ladi. yuqori o'tkazuvchanlik SNP aniqlash uchun ushbu texnikadan foydalaning.

4. Metillanishni aniqlash.Metilatsiya insonning ko'plab kasalliklari, ayniqsa saraton kasalligi bilan bog'liq va Laird metillangan va metillanmagan DNK o'rtasidagi farqni aniqlash uchun o'ziga xos primerlar va Taqman zondlari yordamida metillanmagan sitozin urasilga aylanadi va metillangan sitozin ta'sirlanmasligi uchun DNKni kuchaytirilishidan oldin davolovchi Metilayt deb nomlangan usul haqida xabar berdi. .ko'proq sezgir.

Tibbiy tadqiqotlar:

1. Prenatal diagnostika: odamlar genetik materialning o'zgarishi natijasida kelib chiqqan irsiy kasalliklarni davolay olmaydilar va hozirgacha ular turli irsiy kasalliklarning paydo bo'lishining oldini olish uchun faqat prenatal monitoring orqali tug'ilgan kasal chaqaloqlar sonini kamaytirishi mumkin.Bu homilador ayollar tomonidan oson qabul qilinadigan invaziv bo'lmagan usul.

2. Patogenni aniqlash: lyuminestsent miqdoriy PCR tahlili gonokokk, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, inson papilloma virusi, gerpes simplex virusi, inson immunitet tanqisligi virusi, gepatit virusi, gripp virusi, Mycobactyvirus va EBerculosis.An'anaviy sinov usullariga nisbatan yuqori sezuvchanlik, past namuna hajmi, tezkorlik va soddalik afzalliklariga ega.

3. Dori samaradorligini baholash: gepatit B virusi (HBV) va gepatit C virusi (HCV) ning miqdoriy tahlili virus yuki va ayrim dori vositalarining samaradorligi o'rtasidagi bog'liqlikni ko'rsatadi.Agar lamivudin bilan davolash paytida HBV-DNK zardobidagi darajasi pasaysa va keyin yana ortib ketsa yoki avvalgi darajadan oshsa, bu virus mutatsiyasidan dalolat beradi.

4. Onkogenetik test: o'smaning rivojlanish mexanizmi hali aniq bo'lmasa-da, tegishli genlardagi mutatsiyalar onkogen transformatsiyaning asosiy sababi ekanligi keng tarqalgan.Ko'pgina o'smalarning dastlabki bosqichlarida onkogenlarning ifodalanishi va mutatsiyasining kuchayishi kuzatilishi mumkin.Haqiqiy vaqtda floresan miqdoriy PCR nafaqat genlardagi mutatsiyalarni aniqlashda samarali, balki onkogenlarning ifodasini ham aniq aniqlashi mumkin.Ushbu usul telomeraza hTERT geni, surunkali granulotsitik leykemiya WT1 geni, onkogen ER geni, prostata saratoni PSM geni va o'simta bilan bog'liq virusli genlarni o'z ichiga olgan turli genlarning ifodasini aniqlash uchun ishlatilgan.

www.DeepL.com/Translator orqali tarjima qilingan (bepul versiya)


Xabar vaqti: 21-iyun-2022